蛋白電泳 SDS-PAGE及WESTERN BLOT
蛋白電泳 SDS-PAGE原理
SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。實驗使用過程中，還加入DTT或者巰基乙醇，以打開蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。SDS—PAGE常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)（分離膠與濃縮膠）。
一、樣品制備
本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液，每款裂解液會配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。
- 實驗試劑
- 蛋白提取
- 蛋白定量
| 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|
| R0010 | RIPA_ |
| R0020 | 普通RIPA |
| R0030 | 非變性組織細胞裂解液 |
| A8260 | Aprotinin 蛋白酶抑制劑（抑肽酶） |
| P8100 | Pepstatin A 胃蛋白酶抑制劑 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物 |
| T8031 | Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制劑 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物 |
| 539133 | Protease Inhibitor Cocktail Set VI |
| 539134 | Protease Inhibitor Cocktail Set III |
| PC0030 | Lowry法蛋白濃度測定試劑盒 |
| PC0010 | Bradford蛋白濃度測定試劑盒> |
| PC0020 | BCA蛋白濃度測定試劑盒 |
二、蛋白電泳
- 實驗試劑
- 預(yù)制膠
- 制膠
- 上樣及電泳
- 染色
SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實驗室可根據(jù)自己的情況和習(xí)慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。
| 系號 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 系號 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | T8060 | TRIS 三羥甲基氨基甲烷 | 11 | S1051 | 4XSDS-PAGE分離膠緩沖液（PH=8.8） |
| 2 | G8200 | Glycine 甘氨酸 | 12 | S1052 | 4XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液（PH=6.8） |
| 3 | S8010 | SDS 十二烷基硫酸鈉 | 13 | P1016 | 4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇) |
| 4 | A8080 | Acrylamide 丙烯酰胺 | 14 | P1015 | 4×蛋白上樣緩沖液(含DTT) |
| 5 | M8200 | N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺 | 15 | D1070 | 1M DTT |
| 6 | A8090 | Ammonium Persulfate 過硫酸胺 | 16 | A1030 | 10%過硫酸氨 |
| 7 | D8220 | DTT 二硫蘇糖醇 | 17 | T1020 | 1M Tris-HCL (PH6.8) |
| 8 | M8210 | β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇 | 18 | T1010 | 1.5M Tris-HCL(PH8.8) |
| 9 | T8090 | TEMED 四甲基乙二胺 | 19 | S1010 | 10%SDS |
| 10 | A1010 | 30%丙烯酰胺（29:1） | 20 | T1070 | 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液 |
三、WESTERN BLOT
經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分，此技術(shù)稱為免疫印跡（Western blot）。Western blotting檢測系統(tǒng)除需要過氧化物酶標記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學(xué)發(fā)光兩種試劑及相應(yīng)試劑盒。
- 轉(zhuǎn)膜
- 顯色
Millipore和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um兩種規(guī)格。 轉(zhuǎn)膜后還可以用P0012（10×麗春紅）檢測轉(zhuǎn)膜效果，尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節(jié)省成本和時間，您可以選擇本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）對用過的膜進行清洗，隨后，可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗。 膜再生液實質(zhì)是在不影響膜上結(jié)合的抗原的條件下將抗體洗脫下來，實際操作中，膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意：適用于 ECL和類似的化學(xué)發(fā)光試劑進行的 Western 檢測。不適用于非化學(xué)發(fā)光試劑進行的 Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP。
| 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|
| P0012 | 10×麗春紅 |
| SW3010 | 膜封閉液 |
| A1800 | 抗體稀釋液 |
| A1810 | 一抗稀釋液 |
| A1820 | HRP標記抗體稀釋液 |
| A1830 | AP標記抗體稀釋液 |
| A1840 | 熒光抗體稀釋液 |
| T1085 | 1×TBST |
實驗操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。